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雙螢光素酶實驗的具體步驟

2022-11-18 15:55:14

1、報告基因質粒的構建。將目的片段插入到熒光素酶表達的報告基因載體上,如pGL3-basic。

2、轉染細胞。將報告基因質粒和phRL-TK(內參)共轉染細胞,根據需要對細胞進行處理。共轉染時,由于內參具有很強的啟動子,因此報告基因質粒:內參轉染量一般為10:1~50:1。天津組學實驗

Luciferase活性測定:

⑴ 初次使用時,配制LAR II,即Firefly luciferase的底物。將LAR II溶解在LAR II buffer中,并分裝-80℃避光保存。

天津組學實驗,雙熒光素酶實驗,qPCR

⑵ 加入1X PLB,室溫裂解細胞15 min。

⑶配制Stop&Glo,即Renilla luciferase的底物,能夠終止LAR II的反應。雙熒光素酶實驗

⑷ 測定熒光值。向40 ul的LAR II中加入10 ul細胞裂解液,吹打混勻后,檢測讀數,即為Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo,再次讀數,即為Renilla luciferase的值。qPCR

⑸ 數據處理。首先計算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值,再以control組的比值為單位1,即可得到不同處理組的相對luciferase活性,也就是該處理組基因轉錄的調控活性。


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