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干貨分享:設計完美蛋白組學實驗的方法

2023-05-24 10:59:35

個步驟讓您擁有良好蛋白組學實驗設計






成功的實驗具有可重復性,且不會因為實驗室條件的不同該改變。實驗設計所用的技術、深入的處理方法都非常重要。下圖展示的是實驗設計的基礎流程,可幫助研究者無偏差而高效的完成蛋白組學實驗。





1.明確實驗目標和相關響應變量






首先要明確實驗目標,如“將測量什么”、“和哪個樣品組進行比較”等,這些是將要研究的響應變量和實驗因素,以確定它們對實驗結果的影響。響應變量是用來回答研究問題的實驗成果,在定量蛋白組學中是肽鏈或蛋白的豐度,在蛋白組學中是不同樣本中的差異蛋白。選擇實驗方法至關重要,有MRM、DDA、DIA等可選項。另外,還需要評估效應大小以判斷需要的樣品用量。在早期的biomarker篩選階段,只要是顯著差異的就行,而在毒性研究中只有引起生理差異的才有價值。





2.列舉相關因素






相關因素是影響響應變量的潛在因素。理想情況下響應只受實驗系統中生理性質的影響,但實際情況復雜得多。如肽段峰面積不僅取決于該肽的豐度,還取決于電噴霧的穩定性、色譜柱殘留和蛋白水解效率。在實驗中改變的因素稱為實驗因素,它們對所有樣本的影響不一定都相同,例如試劑批次、一天運行LC-MS時的上樣順序和人為因素等,因此需要盡量將這些因素的影響降到可能小。





3.設置對照樣本和質量控制步驟






在此可以設置2種對照:實驗對照和質控樣品。前者保證樣品性質如保留時間、m/z和豐度信息的準確性,后者可以設置已知豐度的蛋白,以評估儀器檢測的準確性。質控樣本可以告知我們儀器是否正常運行,以及性能如何。評估有性能的分析軟件有NIST、QuaMeter tool和SProCoP等。





4.優化實驗流程






供應商的Protocols為實驗提供了關鍵部分的詳細流程,但為確保實驗正常進行還需調整多種參數。如安捷倫噴射流電噴霧電離源具有六種調節功能,有干燥氣體溫度、霧化器電壓和毛細管電壓等。但要使實驗系統整體正常運行,還需要調整其他許多參數。幸運的是有很多系統方法可以優化設置,如RSM(Response Surface Methodology)。在發表的文章中也可找到多種優化參數、提高蛋白組學性能結果的例子。





5.估算樣品數量






研究中需要避免因為樣品重復和技術重復不夠的問題,否則會出現假陽性/假陰性結果。因此,我們必須評估需要多少樣品并設計相應實驗。這將涉及2點:一是我們探究的影響(信號)有多大,另外一個是組間樣品的響應變量情況。通過預實驗來檢測噪音水平是實驗設計的關鍵步驟。作者推薦每組中至少設置10個獨立樣本以評估其變量,一個生物樣本測定5次。這將花費不菲,但從中獲得的知識是成功進行后續實驗的關鍵。





6.進行實驗






一個好的實驗設計應該能回答研究問題,并且不會產生有偏差的實驗結果?,F代實驗設計可以追溯到R.A. Fisher在1926年發表的工作。他奠定了實驗設計的三大里程碑:封阻、隨機性和重復性,前兩者可消除偏差,第三者可以增加信號-噪音的比率,得到更準確的結果。


 


01

封阻




很多因素會隨著實驗的進行而改變,如試劑批次、人為因素、日期等等。封阻是解決以上問題的辦法。運行一個小的平衡實驗。例如,如果每天只能運行八個樣本,那么可以從兩個組中各選擇4個樣本進行實驗,如此一來,響應變量的任何變化對2個組中的影響都相同。




02

隨機性




有些實驗無法很好進行封阻,例如96孔板的邊緣對實驗結果有影響,這時候隨機分布樣本就能簡單有效的解決這個問題。隨機可以抵消未知因素引起的結果偏差,這在縱向收集樣本時尤為重要。圖2展示了一個隨機實驗設計的例子。



 


03

重復性




設置重復的目的是減少隨機測量偏差。重復分為生物學重復(多個獨立隨機樣本)和技術重復(多次測試),前者可以反映群落的整體情況,后者能消除實驗過程的噪音。例如,病人對治療的響應各不相同,一個樣本得到的結果可能和群體平均信息相差巨大,因此需要設置多個樣本。而當實驗室程序引入的可變性達到或大于種群可變性的規模時,技術重復就顯得更重要了。像蛋白質鑒定實驗中,通常依賴重復運行LC-MS/MS積累的數據來完善蛋白質鑒定結果,那些變化大的步驟可通過流程優化或技術重復來補救。
 
設置盲實驗能使結果更加具有說服力,對照樣本也是實驗中必須包含的部分,陰性/陽性樣本能驗證整個實驗工作流程是否正常運行,讓研究者解釋陽性結果的正確性。



7.統計分析





目前有很多分析平臺可以對蛋白組學數據進行免費處理,包括蛋白鑒定、蛋白定量和統計分析。常用的方法是t檢驗和ANOVA,當然,也可以選擇非參數檢驗方法。進行封阻實驗的,在分析時還必須將其考慮在內(以便在評估噪聲水平時忽略這些變量可能存在的巨大差異)。值得注意的是,統計方法必須與研究問題及實驗設計相匹配。


組學實驗


總  結



執行一個好的實驗設計并不會比執行差的設計花費更多努力。R. A. Fisher提出的三個重要準則是封阻、隨機和重復。建立正確的QCs能消除因系統因素而造成的實驗誤差,也能檢測到長期運行時性能的改變。鼓勵大家通過公共存儲庫(如proteomexchange.org)分享蛋白組學數據,這能減少不必要的重復研究,而且也能比較相似數據集的質量和準確性。目前尚無運行LC-MS的質量控制標準,而共享這些信息可以大大簡化調試和優化蛋白質組學實驗的過程。細胞動物整體實驗



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