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組學實驗-轉錄組測序

組學實驗-轉錄組測序

  • 所屬分類:組學實驗服務
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  • 發布時間:2022-02-16 17:06:10
  • 產品概述

產品介紹

轉錄組測序的研究對象為特定細胞或組織在某一功能狀態下轉錄出來的mRNA集合,通過oligo-dT磁珠捕獲帶polyA尾的RNA進行建庫測序,也稱為PolyA-Seq??裳芯縨RNA差異表達或檢測結構變異,篩選與疾病或性狀相關的分子標記;還可揭示轉錄組的復雜性,確定基因以及轉錄本結構、可變剪接、RNA編輯、帶polyA尾的非編碼RNA 和新轉錄本。目前已廣泛應用于基礎研究、分子育種、臨床診斷和藥物研發等領域。

? Total RNA提取:根據不同的樣品類型采用不同的提取方案,獲得高質量的Total RNA。

? RNA質量檢測:Nanodrop檢測RNA樣品濃度及純度;瓊脂糖凝膠電泳及Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA樣品完整性。

? mRNA捕獲:采用oligo-dT磁珠捕獲帶Poly A結構的mRNA組學實驗

? RNA片段化:采用mg2+離子打斷的方法,將RNA片段化至200-300bp。

? cDNA合成:隨機引物反轉錄合成cDNA第①鏈;在合成cDNA第二鏈時摻入dUTP標記第二鏈,保留了RNA的鏈方向性(可選)。

? 加A尾,接頭連接:cDNA兩端引入接頭序列及標記樣品的index序列。

? PCR富集:PCR富集文庫片段,文庫大小為300-400bp。

? 文庫質檢:Agilent 2100 Bioanalyzer檢測文庫大小分布,Qubit 3.0或熒光定量PCR測定文庫濃度。

? 上機測序:根據數據量要求將文庫pooling上機測序。

? 數據分析:下機數據由專業生物信息分析團隊進行數據分析,提供全面數據分析報告。

樣品要求

? 樣品類型:細胞、新鮮組織或RNA樣品。雙熒光素酶實驗

? 樣品量:細胞樣品請提供至少1×106個細胞,組織樣品請提供至少100 mg的組織塊或切片,RNA樣品請提供5 μg以上的總RNA。

? 樣品質量:RNA無明顯降解,提取的總RNA,OD260/280值在1.8~2.2之間,濃度≥500 ng/μL,28S:18S ≥ 1.5,RIN ≥ 7。

? 樣品保存:

 細胞樣品:收集細胞至RNase Free 1.5 mL EP管,棄去培養基,用PBS洗一次,棄去PBS,把細胞沉淀保存在-80℃。

 組織樣品:組織樣品離體后放在凍存管中,迅速置于液氮下速凍1分鐘以上,然后保存在-80℃。

RNA樣品:可將RNA溶于RNase Free 的超純水中,-80℃保存。

 樣品保存期間避免反復凍融。

? 樣品運輸:樣品置于1.5 mL管中,封口膜封好,干冰運輸。細胞動物整體實驗

測序方案

測序模式 PE150

測序數據量 6Gb clean data

生物信息分析內容

1 原始數據質控檢查

2 比對結果質控檢查

3 基于基因表達的樣品主成分分析

4 差異基因表達分析

5 差異基因GO功能分析

6 差異基因通路分析

7 變異剪切分析

8 基因突變分析

9 轉錄調控活性分析及通路互作分析

 


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